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血清碱性磷酸酶(ALP)测定的几种常用方法,以及它们之间有何差别
 
作者:生化中国 文章来源:生化中国 点击数: 更新时间:2008-3-19 21:24:34
 

    一般正常成年人血清ALP主要来自肝脏,而来自骨组织的ALP一般少于总活性一半。其各自含量与年龄密切相关,但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP,特别是血型为分泌型B型或O型的人。

    现已知人体含4型ALP同工酶,即肠型(IALP)、胎盘型(PALP)、生殖细胞型(GALP)和非特异组织型(TUALP)ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。

    [临床意义]

    肝胆疾病,尤其是阻塞性黄疸患者,该酶活性显著升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。

    [测定原理]

    在碱性条件下,碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚,在405nm测定对硝基苯酚生成的速率,这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。

    [常用测定方法]

    测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度,特别是缓冲液种类的影响,目前,国际上生化试剂主要生产厂家,生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用,并可作为磷酸的受体参与反应,因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中,二乙醇胺(DEA)的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)的激活作用更强。因此用不同缓冲液测定的ALP活性,其参考值不同。

    不少国家,包括我国,多采用AMP或DEA做缓冲液,但这两类物质不易提纯,前者常混有5-氨基-3-吖-2,

    2,5-三甲基乙醇,后者易含一乙醇胺,均对ALP有抑制作用。故日本学者建议采用2-乙氨基乙醇缓冲液,而德国学者建议使用甲基葡萄糖胺缓冲液,此类试剂纯度高,不含抑制ALP活性的物质,可不加螯合剂,其pK值高于DEA。根据所使用的激活型缓冲液不同,目前常用的检测方法主要有四种:

    1、   IFCC推荐方法:AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)缓冲液

   正常参考范围:45~130 U/L,37℃

    2、   JSCC推荐方法:EAE(2-乙氨基乙醇)缓冲液

    正常参考范围:115~359 U/L,37℃

    3、   GSCC推荐方法:DEA(二乙醇胺)缓冲液

    正常参考范围:80~260 U/L,37℃

    4、   DSKG推荐方法(新GSCC方法):MEG(N-甲基-D-葡萄糖胺)缓冲液

    正常参考范围:45~130 U/L,37℃

    二、甘油三酯(TG)常用测定酶法中,为什么采用推荐方法—去除游离甘油的二步酶法优于一步酶法?

    血脂异常是动脉粥样硬化性疾病的重要危险因素之一,甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度与低密度脂蛋白胆固醇(HDL-C与LDL-C)是四项基本指标。临床上制定四项血脂的合适水平或异常水平的划分标准、治疗指针及治疗目标,必须在血脂测定结果准确性的基础上进行。由于TG的脂肪酸组成复杂,而且血中还有游离甘油与不完全甘油酯,使TG测定的结果的准确性显得尤其重要。TG测定的常规方法,国内普遍采用甘油磷酸氧化酶法,也是检验学会的推荐方法,但目前因为商品试剂大都未用二步酶法去除游离甘油,这对多数住院病人是不合适的。

    [测定原理]                                                                 

    标本中的游离甘油经第1试剂中甘油激酶(GK)作用,最后生成过氧化氢,再经过氧化氢酶分解成H2O,使游离甘油的影响被消除;另外,维生素C由维生素C氧化酶去除。第2试剂中TG等经脂蛋白脂酶(LPL)等作用所产生的过氧化氢,在POD的作用下,使4-氨基安替比林(4-AA)与HDAOS发生氧化缩合,生成紫色的醌色素,通过测定该色素的增加,求出TG浓度。以SYSMEX公司生产的二步酶法TG测定试剂盒为例:

    第一步反应:

    抗坏血酸 + 1/2O2    AOD   脱氢抗坏血酸 + H2O

    游离甘油 +  ATP      GK    3-磷酸甘油 + ADP

    3-磷酸甘油   +    O2   GPO   磷酸二羟丙酮 +  H2O2

    H2O2 过氧化氢酶   H2O + 1/2O2

    第二步反应:

    甘油三酯 + 3H2O      LPL   甘油 + 3分子游离脂肪酸

    甘油  +  ATP    GK   3-磷酸甘油 +  ADP

    3-磷酸甘油    +   O2   GPO磷酸二羟丙酮 +  H2O2

    2H2O2   +  4-AA   +    HDAOS      POD  醌类染料

    [参考值 ]                                                                 

    高甘油三酯血症: 1.69mmol/L以上(150mg/dL以上)。

    [说明]

    现阶段允许一步酶法与两步酶法并存,要求逐步过渡到统一采用两步法。在未统一方法前,实验室报告TG测定结果时应注明“去FG值”或“未去FG值”,这将有助于临床医生对结果的正确判断。
    正常人血清FG浓度平均约0.11mmol/L(10mg/dl),在糖尿病、服用含甘油的药物、静脉营养、情绪应急、血标本污染时,FG将明显增高,以致影响对TG水平的判断。
    国外学者建议:临床实验室应备有可以去FG空白的试剂,供必要时采用;糖尿病及特殊门诊以及TG>2.3mmol/L者,最好作FG空白校正。

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